Elaboration d'une nouvelle plateforme de développement de traceurs in vivo (application à l'imagerie de la néoangiogenèse tumorale)

L imagerie moléculaire est aujourd hui un outil non-invasif essentiel pour le diagnostic de nombreuses pathologies. Les traceurs technétiés sont actuellement les plus répandus car le 99mTc est facilement disponible, abordable et présente des caractéristiques idéales pour l imagerie. Néanmoins, le développement de traceurs efficaces nécessite un long et coûteux processus d optimisation souvent empirique. Dans ce contexte, nous avons entrepris le développement d une plateforme technétiée conçue pour présenter au sein de sa structure de nombreux sites potentiels de fonctionnalisation et compatible avec une approche combinatoire.Dans un premier temps, un ensemble de 12 ligands N3X (X = N, O, S) a été préparé. Chacun d entre eux présente dans sa structure un motif triazole introduit par chimie-click et intervenant dans la complexation du métal par un de ses atomes d azote. Nous avons ensuite évalué l aptitude de ces ligands à chélater le cœur oxotechnétium dans des conditions douces (5 min, température ambiante) compatible avec une utilisation en milieu hospitalier. Le complexe TriaS-99mTc a été formé quantitativement et sa stabilité en plasma murin a été étudiée. Il s est révélé stable à plus de 90% dans le plasma murin après 6h d incubation. L étude in vivo de ce complexe a par la suite révélé une élimination efficace du milieu circulant par la voie urinaire avec une dégradation minoritaire.A titre d illustration, nous avons ensuite engagé la structure TriaS dans deux approches distinctes pour le développement de traceurs de la néoangiogenèse tumorale en ciblant l intégrine avb3. D une part, dans le cadre d une approche intégrée, plusieurs complexes fonctionnalisés, mimes de RGD, ont été obtenus. Dans chaque cas, l adjonction de groupements fonctionnels n a pas affecté l efficacité de la chélation. En outre la stabilité en plasma est maintenue à un niveau très correct. D autre part, nous avons développé une approche bifonctionnelle dans laquelle le motif c(RGDfK) joue le rôle de molécule ciblante. Dans ce cas, un motif variable (ici un PEG) peut être introduit par chimie combinatoire pour moduler la solubilité, la biodistribution, et l excrétion des traceurs.Molecular imaging is an essential non-invasive tool usable for diagnosis and characterisation of many diseases. Technetium-based tracers are the most popular ones due to disponibility, cost and radiochemical properties of 99mTc. Nevertheless, effective tracers development requires a long, expensive, and mainly empirical optimisation process. This context prompted us tu carry on the development of a new technetium structure which exhibits lots of potential functionalisation spots compatible with a combinatorial approach. We synthesised 12 N3X (X = N, O, S) different ligands. Each of them includes a triazole moiety, (formed via a click-chemistry reaction), which is involved in the metal complexation that implies one of its nitrogen atoms. Then we evaluated their ability to readily form oxotechnetium complexes in conditions that are compatible with medical use in hospital. One complex was formed in quantitative yields and its stability in mice plasma was investigated. A complex called TriaS-99mTc, stable to more than 90% after 6h incubation, was selected. In vivo study of TriaS-99mTc revealed an efficient blood clearance via the urinary excretion pathway with very low degradation. As an application, we used this structure for the development of tracers that target integrin avb3, a known biomarker of tumor neoangiogenesis. First, we synthesised functionnalised TriaS-based integrated complexes. Fonctionnal modification of TriaS by addition of side chains and substituents did not affect its ability to chelate oxotechnetium quantitatively. In addition, its stability in mice plasma was satisfactory. We also developped a bifonctionnal approach using c(RGDfK) peptide as the targeting biomolecule. In this way, a variable moiety (herein a PEG moiety) can be inserted in the structure through click-chemistry in order to modulate tracers solubility, biodistribution and excretion.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Secretory IgA mediates retrotranscytosis of intact gliadin peptides via the transferrin receptor in celiac disease

Celiac disease (CD) is an enteropathy resulting from an abnormal immune response to gluten-derived peptides in genetically susceptible individuals. This immune response is initiated by intestinal transport of intact peptide 31-49 (p31-49) and 33-mer gliadin peptides through an unknown mechanism. We show that the transferrin receptor CD71 is responsible for apical to basal retrotranscytosis of gliadin peptides, a process during which p31-49 and 33-mer peptides are protected from degradation. In patients with active CD, CD71 is overexpressed in the intestinal epithelium and colocalizes with immunoglobulin (Ig) A. Intestinal transport of intact p31-49 and 33-mer peptides was blocked by polymeric and secretory IgA (SIgA) and by soluble CD71 receptors, pointing to a role of SIgA–gliadin complexes in this abnormal intestinal transport. This retrotranscytosis of SIgA–gliadin complexes may promote the entry of harmful gliadin peptides into the intestinal mucosa, thereby triggering an immune response and perpetuating intestinal inflammation. Our findings strongly implicate CD71 in the pathogenesis of CD

T84-intestinal epithelial exosomes bear MHC class II/peptide complexes potentiating antigen presentation by dendritic cells: Function of intestinal epithelial exosomes

International audienceBackground and aims: Intestinal epithelial cells release antigen presenting vesicles (exosomes) bearing MHC class II/peptide complexes stimulating specific immune responses in vivo. To further characterize the role of human epithelial exosomes in antigen presentation, their capacity to load antigenic peptides, to bind immune target cells and to induce T cell activation was analyzed in vitro. Methods: The capacity of exosomes derived from the HLA-DR4 expressing, intestinal epithelial cell line T84, to load the HLA-DR4-specific peptide 3H-HSA 64-76 and to activate a HLA-DR4-restricted T cell hybridoma, was tested in the presence or absence of human monocyte-derived dendritic cells (DCs). Interaction of FITC-labeled exosomes with T cells and DCs was analyzed by flow cytometry and confocal microscopy. Results: T84-derived exosomes, enriched in CD9, CD81, CD82 and A33 antigen, were capable of binding specifically HSA 64-76 peptide on HLA-DR4 molecules and of interacting preferentially with DCs. HSA-loaded exosomes were unable to activate the T cell hybridoma directly, but induced a productive T cell activation through DCs. When HSA peptide was bound to exosomal HLA-DR4 molecules instead of in a soluble form, the threshold of peptide presentation by DCs was markedly decreased (x10-3). Conclusions: Exosomes released by intestinal epithelial cells bear exogenous peptides complexed to MHC class II molecules and interact preferentially with DCs, strongly potentiating peptide presentation to T cells. Epithelial exosomes constitute a powerful link between luminal antigens and local immune cells by mediating the transfer of tiny amounts of luminal antigenic information and facilitating immune surveillance at mucosal surfaces

Carboxylations dependant de la vitamine K: contribution a l'etude de l'introduction du CO_2; conception d'inhibiteurs irreversibles

SIGLEAvailable from INIST (FR), Document Supply Service, under shelf-number : T 78066 / INIST-CNRS - Institut de l'Information Scientifique et TechniqueFRFranc

Chimiothèques de complexes du technétium et du rhénium ciblant l intégrine alphaVbéta3 (développement de traceurs pour la détection précoce de la néoangiogenèse tumorale)

Les intégrines sont des protéines membranaires hétérodimériques impliquées dans l'adhésion et la migration cellulaire. Elles sont notamment surexprimées lors de la néoangiogenèse tumorale. Une dizaine d'entre elles reconnaît un motif peptidique RGD structuré. Des analogues de cette séquence peuvent être utilisés pour la détection précoce de tumeurs et de métastases. Nous avons entrepris de développer de nouveaux traceurs, marqués au 99mTc, spécifiques de l'intégrine alphaVb3. Ne disposant d'aucun modèle prédictif fiable de la structure des complexes d'oxotechnétium au début de ce projet, nous avons préféré une approche combinatoire et avons choisi d identifier les traceurs efficaces par un criblage in vivo. Cette méthode permet de prendre en compte au plus tôt les aspects de biodistribution et de pharmacocinétique. Les traceurs ont été obtenus selon deux stratégies : cyclisation d analogues linéaires de RGD ou assemblage combinatoire de motifs indépendants par coordination du cœur oxotechnétium par le motif NS2+S. La stabilité des traceurs a été testée en présence de glutathion et dans le plasma. Une première évaluation in vitro sur intégrine purifiée a montré que l un des peptides RGD, cyclisé par le rhénium, se lie spécifiquement àalphaVb3. Un modèle tumoral (tumeur U87-MG, souris nude) a été validé au laboratoire et une méthode d'analyse du criblage in vivo a été mise au point à l'aide de composés modèles. Il s'avère que les données de biodistribution et le pourcentage d'activité retrouvé dans la tumeur sont encourageants pour les complexes cycliques, bien que l'identification des traceurs efficaces soit rendue difficile par leur instabilité dans les conditions d analyse.Integrins form a family of heterodimeric integral glycoproteins which play a central role in cell-cell adhesion and cell-matrix interactions. In particular, they are overexpressed during tumor neoangiogenesis. About 10 of them recognize a structured RGD (Arg-Gly-Asp) sequence. Analogs of this sequence can be used for the early detection of tumors and metastases. We developed new tracers, labeled with 99mTc, for the molecular imaging of alphaVb3 integrin. Until recently, there was no reliable ab initio structure prediction of complex molecules containing Re and Tc chelates. Therefore, we preferred a combinatorial approach to develop potential ligands of alphaVb3 integrin and we attempted to identify efficient tracers by in vivo screening. This method would account for biodistribution and pharmacokinetics properties in the early steps of the study. Tracers were obtained according two strategies: i) cyclization of linear RGD analogs; ii) combinatorial assembling of independent modules through metal core coordination by the well-known NS2+S motif. After synthesis and labeling, the stability of the tracers was investigated in presence of glutathione and in murine plasma. In vitro screening on purified integrin showed that a cyclic rhenium coordinate binds specifically alphaVb3. A tumor model (U87-MG tumor on nude mice) was validated in the laboratory and a method was developed to analyze in vivo experiments. Biodistribution data and percentage of activity found in tumors are encouraging for cyclic compounds though identification of efficient tracers is difficult due to their instability in the conditions of analyses.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Isotopics – Isotopic labeling for Drug Innovation - H2020

International audienceISOTOPICS (H2020 - Marie Sklodowska-Curie Actions - Innovative Training Network; grant number 675071) combines researchers and industry in an innovative effort to de-risk drug development, create new tools for medicine and train first-class radiochemists with dual academic-industrial expertise

Développement de ligands de protéines par assemblage combinatoire autour d'un coeur de rheniumV (application à la cyclophiline hCyp-18)

Cette thèse décrit une nouvelle stratégie pour le développement de composés organométalliques bioactifs, reposant sur l'assemblage combinatoire de sous-chimiothèques (A et B) indépendantes mais complémentaires et capables de coordiner un cœur métallique M, pour former des complexes A-M-B ligands potentiels de biomolécules. La coordination des métaux, bien adaptée à la production de diversité moléculaire est couramment utilisée en chimie médicinale, en médecine nucléaire diagnostique et thérapeutique. Parmi les éléments utilisables, le rhénium et le technétium sont des métaux de choix pour le développement notre stratégie d'assemblage en raison de leurs propriétés chimiques et radiochimiques et de l'analogie de structure de leurs complexes. Notre principal objectif à été de valider cette stratégie in vitro sur une protéine modèle, la cyclophiline hCyp-18 bien connue au laboratoire. C'est une peptidyl-prolyl isomérase reconnaissant principalement des ligands peptidiques ou pseudo-peptidiques, via deux sous-sites fonctionnellement indépendants liant d'une part le résidu proline (sous-site S1-S1') et d'autre part l'extrémité p-nitroanilide (sous-site S2'-S3') des peptides modèles. Nous avons donc développé puis validé in vitro une nouvelle stratégie de synthèse de ligands de protéines par assemblage combinatoire autour du cœur oxorhénium. Nous avons aussi sélectionné de nouveaux ligands de hCyp-18 présentant une meilleure affinité que le peptide de référence Suc-AAPF-pNA. A partir des chimiothèques de modules déjà préparées, nous avons également initié la sélection des ligands de hCyp-18 par chimie combinatoire dynamique.This manuscript describes the development of a novel strategy for the synthesis of organometallic compounds usable as protein ligands, pharmacophores and tracers for molecular imaging through combinatorial assembly of independent modules. Each supramolecular entity is composed of two molecules A and B which are able to coordinate a metal core M in a complementary and unambiguous way to give a metal complex A-M-B. Among a wide variety of metal cores utilized in supramolecular chemistry and nuclear medicine, we selected the oxorhenium and oxotechnetium cores which feature similar interesting chemical and radiochemical properties. The main goal of this work was to validate the strategy in vitro using a model protein, the human cyclophilin hCyp-18, a peptidylprolyl isomerase (PPIases) implicated in numerous biological processes and diseases. Moreover, hCyp-18 possesses two functionally independent subsites which have been thoroughly characterized by NMR, X-ray crystallography and structure activity relationship studies. We developed novel metallated cyclophilin ligands through oxorhenium coordination of independent peptide moieties which reconstitute a canonic PPIase substrate, tetrapeptide Suc-AAPF-pNA. Assembly and biochemical screening of two libraries led to the selection of 2 complexes which exhibit affinities improved by one order of magnitude relative to the reference peptide. Moreover, a Cys-pNA oxorhenium coordinate devoid of proline analog displayed an interesting affinity for cyclophilin. We also initiated the evolutionary selection of cyclophilin ligands via a dynamic combinatorial chemistry.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF